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　　二代测序(NGS)又称大规模平行测序，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标，是继Sanger测序之后的革命性进步，具有划时代的意义。由于高通量测序一次可检测大量靶基因及其变异位点，检测灵敏度和特异性高，兼具定性和定量检测，并且与其他方法相比，同样数量的基因和位点检测费用比较低，因此在无创产前筛查（NIPT）、肿瘤基因突变、遗传病、胚胎植入前遗传学筛查（PGS）、胚胎植入前遗传学诊断（PGD）、病原微生物及宏基因组学等领域展现了极为广阔的临床和科研应用前景，成为目前DNA和RNA序列分析最高效的工具，也是精准医学时代研究和临床疾病诊疗的支撑技术，是的基因组学和转录组学迅速由概念走向临床疾病诊疗实践，预示着疾病诊疗分子时代的到来。目前在临床肿瘤实践中，NGS主要应用于驱动基因测序，是肿瘤精准诊疗的重要环节。

高通量测序技术的特点：

　　>操作步骤多、程序复杂，既包括实验室内的样本预处理、核酸提取、定量、质控及片段化（基因组或大片段核酸分子检测时）、建库 、扩增、靶序列富集、文库定量、混样、测序前准备及测序等过程；

　　>后续还包括测序后的数据质量分析、比对、变异识别、注释和结果报告与解释等生物信息学分析流程。

　　上述任一环节出现问题，均会影响检测结果的准确性，进而影响临床决策。

问题存在价值丢失：

　　在我国现阶段，肿瘤患者数目庞大，驱动基因诊断和检测应用需求巨大。但在实际应用中会因为检测技术的准入门槛低、缺乏临床公认的NGS指导规范，肿瘤诊治中可能存在检测质量低下、结果准确性差，检测结果解读不专业，甚至盲目追求基因检测结果的现象。因此，若上述环节出现问题，将导致研究/诊断失去可靠价值。

幸运的是：

　　在今年的7月份，《中华医学杂志》在线发表了题为《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》的最新文章。文中系统地阐述了NGS技术质量需求、临床肿瘤相关NGS检测内容、样本处理、测序流程、数据管理、信息学分析、结果报告解释和咨询等方面的内容，就NGS临床应用中的多方面问题进行了讨论和规范性建议。

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二代测序核酸样本的质量控制

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1　NGS应用中的样本处理

　　NGS检测需文库构建，该步骤原始材料为DNA或来自RNA的cDNA。适合临床NGS分析的样本类型优先选择新鲜组织标本，也可选用甲醛固定－石蜡包埋(FFPE)样本、肿瘤细胞学标本及血浆(游离DNA/RNA)等

各类样本采集：

　　(1)对于手术和活检的新鲜组织：理想的保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80 ℃冰箱，该过程应在手术离体后30 min内完成，以防止RNA等核酸降解；或采用保存在样本保护剂中，尽早转移到-80 ℃冰箱保存。可采用冷冻切片染色评估样本中的肿瘤细胞含量。

　　(2)FFPE：按病理操作规范进行取材。手术或活检离体的组织应在30 min内浸入100 ml的4%甲醛溶液中进行固定，避免使用酸性及含有重金属离子的固定液。大标本应切开后充分固定至6～48 h，不超过72 h。小活检标本可固定6～12 h。开展NGS检测前应进行HE染色评估肿瘤细胞的含量。

　　(3)细胞学样本：脱落细胞学标本及细针穿刺细胞学标本用于基因检测时，必须进行病理质控，确定标本中的肿瘤细胞数量及与正常细胞的比例，符合质量要求或通过肿瘤细胞富集处理后符合要求的标本可直接抽提核酸，也可以制备成FFPE细胞学蜡块进行后续分析。体腔积液标本可提取无细胞上清标本中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行检测。

　　(4)血浆或血液样本：ctDNA是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊。采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时应使用一次性的含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝真空采血管，采集8～10 ml全血，冷藏运输，2 h内分离血浆，提取游离DNA，保存于-80 ℃冰箱中，并避免反复冻融。如外周血需长时间运输，建议用商品化的游离DNA样本专用保存管（推荐选择启衡星cfDNA采血管，高质量，高性价比），在常温条件下，ctDNA在全血中可稳定保存达14d（启衡星）。由于血细胞基因组DNA的潜在大量释放会极大地稀释血浆游离肿瘤DNA的浓度，经肉眼观察确认为溶血的样本不适用于对游离肿瘤DNA的NGS检测。当怀疑血浆游离DNA受到血细胞基因组DNA污染时，可考虑采用核酸片段大小分布分析来判断污染是否存在，而从判断样本是否适用于NGS检测。

2　核酸提取

　　不管是血液样本还是新鲜的组织或FFPE样本，市面上的产品都比较成熟（像Qiagen，Life，Promega等），根据样本量大小以及具体需求选择膜柱法或磁珠法核酸提取试剂盒。

3　核酸质量评估

　　首先，评价基因组DNA及RNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。但对于cfDNA来说，通常提取得到的浓度非常低，通常不用分光光度计和凝胶电泳去定量和纯度分析，但会用到染料法（例如qubit）进行核酸定量以及微流控方法分析片段大小以及是否由基因组污染。

凝胶电泳法

　　基因组DNA的完整性和大小，可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高，但是，它仍然能够提供完整性（大小范围）和纯度（RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。因此，它仍然是评价基因组DNA及RNA质量的有效方法之一。

注：RNA污染会导致DNA浓度高估，并且抑制一些下游步骤。如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNase I处理样本。

　　分光光度测定法分光光度法原理为核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的 紫外吸收峰在260nm波长处。一般在260nm波长下，每1ml含1μg RNA溶液的光吸收值为0.022〜0.024,每1 ml含1μg DNA溶液的光吸收值约为0.020,故测定未知浓度RNA 或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。NanoDrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测，它无法区分出 DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。

微流控分析法

　　微流控分析法（如PE的LabChip GX，安捷伦2100）通过微流体技术对样品进行分离。通过加入电压，使与荧光染料结合的样品在芯片上的显微蚀刻管道进行分离。根据核酸分子大小的不同而迁移率的不同进行分离，并通过激发光使染料发出荧光，使其能被仪器检测到。再根据已知的分子量及含量的Ladder计算DNA迁移时间和大小的函数关系，根据公式计算样品的分子量大小及浓度。

　　第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法

　　核酸的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定。Molecular Devices（MD公司） 的Quickdrop，Thermo公司的Nanodrop目前被广泛使用，因为它需要的样本量少(0.5-1 µl)，并且使用方便（不需要比色皿）。为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。

注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。RNA污染物会导致DNA浓度高估。但是，纯净RNA的A260/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。因此，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA杂质。

　　注：苯酚在270–275 nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260 nm附近的吸光度，从而导致高估DNA的产量和纯度。

荧光法荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。染料结合到DNA/RNA上后，能增大特定波长的发光强度，除此之外，也可以使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10,000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。

DNA标准品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。

文库制备

　　对于Illumina测序平台，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：

　　片段化DNA （可选KAPA酶切试剂盒）；

　　对DNA片段进行末端修复；

　　连接接头；

　　对可选的文库进行扩增。

这里就不在过的讲述建库的流程，大家有兴趣可以看我们往期的内容，有非常详细的介绍哦。 

NGS文库质控。

　　高质量的文库是成功进行第二代测序的关键。文库构建包含复杂的步骤，比如片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接接头和扩增文库。根据使用的平台和文库类型，这些步骤也会发生变化。监控每一个步骤非常必要，包括在片段化样本之后检查片段的尺寸，以及连接接头之后检查片段的大小和浓度。文库验证过程中，需要分析文库中片段的大小和数量，这是质控的最后步骤。 

评估文库中片段的大小

琼脂糖和PAGE凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法，它们比较耗时。

　　最近，基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步骤，使用方便。它们具有更高的通量，并且省去了很多的手动操作时间。除此之外，它们的灵敏度更高（对于检测的限制更少），并且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。

　　基于微流技术（LabChip，2100）的电泳和毛细管电泳除了提供片段大小的信息之外，还提供了定量检测数据。但是，电泳、分光光度法和荧光法的一个共同的局限性是，都只检测总的核苷酸的浓度，而非与接头连接的分子的浓度。

Real-time PCR

　　对扩增后的文库中的分子进行精确的定量检测，对于确保片段的质量和高效的获得数据是非常重要的。低估扩增文库中的分子数量，会导致混杂的信号以及难以解析的数据；相反地，高估分子的数量会降低结合模板的珠子或者DNA簇的产量，并且没有充分利用测序能力。

　　Real-time PCR能够特异性的定量检测两端连接有接头的DNA分子，因此能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量检测。Real-time PCR的灵敏性非常高，可以对浓度非常低的文库分子进行定量检测，即使其浓度低于传统方法可以检测的阈值。因此，这种方法能尽量减少对文库的扩增，降低可能的偏倚。