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启衡星高灵敏探针法qPCR Mix篇之:宿主DNA残留检测解决方案

发布日期:2022-05-12 返回列表

随着越来越多的生物制品(如重组蛋白药、抗体药、疫苗以及细胞治疗等产品)参与治疗疾病,对这一类的生物制品的质量控制也日益严格。生产该类生物制品的过程中的细胞培养阶段,由于DNA具有稳定性,在细胞培养过程中宿主细胞残留的DNA中可能存在感染风险或存在潜在的致癌性,免疫原性以及其他毒性,比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。分布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中,这种插入可能影响关键基因功能的发挥,比如激活癌基因或抑制癌基因。此外,由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列,增加了重组蛋白药物在体内的免疫原性风险。为了保证生物制品的安全性,各监管机构(WHOFDANMPA等)对参与治疗疾病的生物制品中的残留DNA制定了严格的标准。


关于外源性DNA残留检测方法,在《中国药典2020》中列出了三种方法,分别是DNA探针杂交法、荧光染色法,以及定量PCR法。相比于DNA探针杂交法和荧光染色法,定量PCR法具有更高的灵敏度,精确性以及重复性。启衡星生物针对极低模板检测而开发的StarLighter高灵敏探针法qPCR Mix(货号:FS-Q3002)可以为宿主核酸残留提供完美的解决方案。

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| 应用案例一一人残留DNA qPCR检测|


优异的性能表现


以人残留DNA检测为例,以人基因组DNA的某一段区域作为靶标,分别设计短(扩增片段<110bp、中110<扩增片段<250bp、长(扩增片段>290扩增片段的引物及探针,以国家计量院标准品人gDNA为模板(30pg/30fg的input量),再分别用不同厂家试剂进行qPCR定量检测。启衡星高灵敏探针法qPCR Mix比其他供应商试剂展现出更好的性能表现。

反应体系&反应程序如下:

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扩增曲线图:

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不同模板量及试剂的Ct值:

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启衡星高灵敏探针法qPCR Mix(蓝色曲线)无论是在荧光值强度还是Ct表现均优于其他供应商试剂的表现。


不同细胞系间无交叉影响,且重复性CV值<15%


以国家计量院标准品人gDNA为模板,将gDNA分别稀释成300 pg/μl30 pg/μl300 fg/μl以及30 fg/μl;在30 μl反应体系中分别加入15 μl2×StarLighter高灵敏探针法qPCR Mix3 μl的引物和探针Mix2.5 μM),10 μl上述稀释好的标准品,Rox 0.6 μl,同时分别加入3 ngNS1Ecolistb13菌株),酵母以及CHO干扰基因组DNA,用水补齐至30 μl,分别对短、中、长片段制作标准曲线;同时用300 pg/μl3 pg/μl30 fg/μl的标品作为未知样本分别对短、中、长片段进行定量检测。定量结果显示,标曲在线性、扩增效率以及R2都表现优异,同时不受干扰基因组的影响。同时对短、中、长片段不同浓度样品的定量准确,重复性CV值均小于15%

短片段标曲以及对不同浓度样品的检测:

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中片段标曲以及对不同浓度样品的检测:

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长片段标曲以及对不同浓度样品的检测:

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稳定性好


多次反复冻融,对短、中、长片段的检测结果无任何影响,标曲线性好。


短片段:

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中片段:

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长片段:

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关于启衡星

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